A pitaya é considerada uma fruta exótica e de alto valor agregado. No Brasil, seu comércio tende a crescer e se popularizar. Em vista disso, a técnica de micropropagação pode auxiliar na obtenção de mudas rápidas, uniformes e com excelente qualidade. Porém, ainda há poucos estudos que visam estabelecer um protocolo para a pitaya da polpa vermelha (Hylocereus costaricensis), sendo assim, este trabalho teve o objetivo de buscar qual o melhor posicionamento do explante no meio de cultura, e a porção do segmento caulinar que apresenta melhor resposta. A metodologia foi feita com cinco tratamentos, (1) com a porção apical, (2) com a porção basal, e os demais sendo com a porção mediana do cladódio com diferentes orientações no meio: (3) vertical, (4) horizontal e (5) horizontal segmentada na metade. A análise estatística aponta diferenças entre quatro variáveis analisadas. A quantidade de brotos entre os tratamentos só diferiu aos 20 dias de cultivo, entretanto, foi possível comparar a distribuição do comprimento das brotações por tratamento (%).